细胞壁在海州香薷铜耐性中的作用及解毒机理研究
【摘要】铜是世界范围内广泛分布的重金属之一,近年来随着工农业的发展和三废的排放,使得环境中的铜含量迅速增加,造成土壤环境中的铜污染日益严重。当植物生长在铜污染的区域中,植物细胞壁不仅仅起到隔绝铜污染的土壤环境与植物内部细胞的屏障作用,而且在植物对重金属铜的防御反应中发挥至关重要的作用。然而,关于植物细胞壁中的铜的积累、耐性、解毒及信号转导的细胞学机理有待进一步的研究。海州香薷(Elsholtziasplendens)是一种高铜耐性植物,其体内铜的积累量高达1000mg/kg的铜,可生存在高铜污染的区域中,是一种铜污染土壤修复的优选植物。因此,本文以海州香薷的细胞壁为研究对象,从亚细胞、蛋白质组学的水平上阐释了海州香薷细胞壁对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理,并构建了细胞壁中压力胁迫的蛋白信号通路。本研究为细胞壁中的压力胁迫应答机制研究提供新的视野,并为土壤铜污染的植物修复提供理论依据和科学支撑。主要研究成果如下：1、采用分级离心法分离细胞不同组份,明确了不同浓度铜胁迫下的铜离子在海州香薷根、茎、叶中亚细胞分布特征及其化学结合形态。细胞壁是Cu的主要积累位点(68%),其次为液泡(26.6%),只有少量的Cu分布在叶绿体等细胞器中。随着铜离子浓度的增加,亚细胞各个组分中的铜含量也相应的增加。铜离子在海州香薷体内尤其是根系中的形态分布和特征与其对铜离子的耐性有着密切的联系。铜离子在海州香薷各组织中结合的化学形态是不同的,在根中,铜离子主要以水溶性有机酸盐结合态铜或难溶性磷酸盐结合态铜的形式存在；在茎和叶中铜离子以难溶性磷酸盐结合态铜占绝对优势,其次为无机盐、蛋白结合态铜为主的形态存在。随着铜胁迫浓度的增加,铜离子由活动性较强的可溶性盐类,蛋白结合态铜向难溶的磷酸盐及草酸盐结合态转化。铜离子与低活性的磷酸盐及草酸盐结合被固定是海州香薷铜耐性和解毒的重要机制。聚类分析证实了铜离子在不同的亚细胞器官中具有不同的化学结合形态,各化学形态和亚细胞分布于铜的迁移能力及生物活性密切相关。2、利用细胞壁化学改性结合吸附动力学试验和红外光谱学研究了海州香薷根细胞壁及其组份对铜离子的吸附动力学特征,以及它们吸附固定铜离子的功能基团。吸附动力学表明,海州香薷根细胞壁对Cu2+具有较高的亲和力,吸附300min后,根细胞壁的铜吸附量已接近于饱和水平,吸附量可以达到最大吸附量的90%左右,500mmin达到吸附饱和,饱和吸附量为5.85mg/g细胞壁。当细胞壁进行化学改性后,如果胶甲基化程度降低,及去除细胞壁中的纤维素后显著降低根细胞壁对铜的吸附量。红外光谱研究也表明,在海州香薷根细胞壁吸附Cu2+的过程中,羟基、羧基和氨基是Cu2+的主要结合位点。其中纤维素和半纤维素为Cu2+的结合提供了羧基官能团,果胶提供了羟基官能团,而细胞壁蛋白提供了氨基官能团等结合位点。细胞壁中果胶和纤维素是铜离子主要吸附结合部位,分别吸附了19.85%和25.48%的铜。此外,蛋白质与果胶,果胶和半纤维素之间存在协同作用共同吸附固定铜。根细胞壁及其各组份对铜离子具有较高的吸附固定能力是海州香薷根系Cu耐性的重要机制。3、分析了细胞壁多糖的组成、含量和分布特征与海州香薷铜耐性之间的关系,测定了三种典型的细胞壁多糖指标(总糖、半乳糖醛酸及3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸)。细胞壁多糖含量变化与细胞解毒过程密切相关。海州香薷通过改变细胞壁组份如(果胶,半纤维素,纤维素)的含量增加对铜的耐受性。多糖为铜离子提供了较多的羧基结合位点,是细胞壁多糖解毒的重要机制。随着铜离子胁迫的增加,细胞壁多糖组分的含量发生变化。其中根,叶中总果胶,半纤维素总糖含量极显著增加(P<0.01),而茎中其含量显著减少,在根、茎、叶中纤维素总糖含量均显著降低(P<0.05)；而根、茎、叶中果胶及纤维素中的半乳糖醛酸含量略微增加,根、叶中半纤维素的半乳糖醛酸含量降低,同时,茎中半纤维素的半乳糖醛酸含量增加。根、茎、叶细胞壁果胶的KDO含量随着铜胁迫的增加均略微增加。植物通过这种行为把大量的铜聚集在细胞壁上,避免了对内部细胞器的胁迫,这也是海州香薷对铜离子胁迫解毒的一种生理响应,同时也揭示了细胞壁特别是细胞壁多糖在海州香薷对铜解毒方面发挥着重要的作用。4、分离海州香薷细胞壁,优化细胞壁蛋白的提取方法,探究海州香薷细胞壁蛋白含量与细胞壁中铜积累量之间的相关性分析。结果显示：在根细胞壁中随着铜离子胁迫浓度的增加,根细胞壁中铜的积累量也是逐步增加的。当铜离子浓度为100μm0l/L时,细胞壁中的铜离子浓度达到最大值1.41mg/g细胞壁干重。根细胞壁蛋白随着铜胁迫浓度的升高先增加后减少,在50μmol/L铜胁迫下,根细胞壁蛋白含量达到最高值,26.85μg/g细胞壁干重。铜在根细胞壁中积累引起细胞壁对铜的一系列响应,包括基因的调控等,从而引起细胞壁蛋白含量的波动性变化。细胞壁蛋白含量变化的波动趋势与细胞壁铜积累量的波动趋势相同,由此说明细胞壁蛋白含量的变化与海州香薷耐铜性的表现趋于一致。在SDS-PAGE蛋白谱图中,根细胞壁蛋白有超过25个蛋白谱带被分离,大多落在标准分子量为10-170kD范围内,在50μmol/L铜胁迫下,根细胞壁蛋白在10-25kD范围内与对照相比条带明显增多。5.iTRAQ技术结合LC-ESI-MS质谱技术分离鉴定了在50μmol/L铜胁迫48h后海州香薷根细胞壁蛋白表达情况。共479个表达蛋白被分离鉴定,其中55个蛋白显著差异表达,其中22个蛋白上调,33个蛋白下调。对根细胞壁差异表达蛋白进行GO分析,探究这些蛋白参与的生物学过程及分子功能,研究表明：23.24%参与了代谢过程,16.20%参与了细胞学过程及14.79%参与了应激反应；41.38%为结合蛋白,31.03%为催化活性蛋白及11.49%为转运蛋白。由此可见细胞壁差异表达蛋白具有多种分子功能,并参与了多种生物学过程。上调蛋白主要参与了抗氧化胁迫、细胞壁多糖修改及修饰及一些代谢过程,下调蛋白主要参与了信号转导、能量及蛋白合成等代谢过程。细胞壁蛋白是外界环境胁迫和细胞壁骨架间交换信息的媒介和桥梁,丰富的细胞壁内部应激相关信号通路及各种代谢过程相互作用共同构建了一个复杂的应激反应网络抵抗铜离子的胁迫。
【作者】刘婷婷；
【导师】施积炎；
【作者基本信息】浙江大学，环境工程，2014，博士
【关键词】海州香薷；铜耐性；细胞壁多糖；细胞壁蛋白；防御与解毒；iTRAQ；
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